钙流高效筛选的不二之选—FLIPR钙6检测试剂盒

Molecular Devices 公司生产的FLIPR 钙离子检测试剂盒采用了钙离子敏感的指示剂以及专利的屏蔽染料以确保研究者进行高灵敏的用于G蛋白偶联受体、离子通道和其它钙离子敏感的靶标的荧光筛选。采用新型的染料构成进一步的提升了钙流结果的检测窗口和实验稳健性，同时实验方案更灵活。如图1所示，FLIPR钙6 试剂含有的屏蔽成分不进入细胞内部，但显著性的降低胞外钙离子指示染料残留、培养基和其它成分引起的背景荧光。FLIPR 钙6-QF 检测试剂盒成分不含有屏蔽组分，对淬灭剂敏感靶标或多通道应用试验提供了一种新的、灵活的选择。另外的应用便利之处在于试验中要求很小的或不加入丙磺舒也可以。许多细胞（例如CHO）具有阴离子交换蛋白，需要加入阴离子再摄取抑制剂，例如丙磺舒，以保持细胞内钙离子指示染料不被转出。

然而，独特的FLIPR 钙 6 检测试剂盒的染料是对有阴离子转运体耐受的，因而只需加入很少不不加入丙磺舒。

FLIPR 钙6 and 钙6-QF 实验准备

在本实验中我们使用的是FLIPR 钙6 (P/N:R8190)和钙6-QF (P/N:R8192) 小包装试剂盒。两者的染料均溶于含20MMHEPES 的Hank’s 平衡盐溶液（HBSS）中。丙磺舒（Probenecid，PBX) 一并加入以防止染料被转移至细胞外。贴壁的CHO M1 细胞实验前一天的晚上被种在384 孔黑色低头的细胞板上，实验前从培养箱中取出分别加入25μL FLIPR钙6、钙6-QF 或钙5 检测试剂盒的染料，或者竞争者的染料，每孔中自身含有25μL 实验缓冲液或培养基。

加载了FLIPR钙6和钙6-QF试剂染料后，在37°C、5% CO2条件下孵育2小时。FLIPR钙5试剂染料和竞争者的染料按照建议的方案实验前在37°C、5% CO2条件下孵育1小时。在FLIPR® Tetra 系统或 FlexStation 3酶标仪中信号检测前从培养箱中取出所有细胞板并在室温下冷却10分钟。加载了FLIPR钙流检测染料或Fluo-4 Direct 染料的细胞板中无需再用缓冲液冲洗。而加载了Fluo-4染料的细胞板需要再用HBSS缓冲液冲洗三次。

FLIPRTetra和FlexStation 3 系统中的钙流检测试验

在384孔聚丙烯化合物板用含20 mM HEPES的HBSS缓冲液溶解配制5倍终浓度的相应的配体化合物。激动剂在实验过程中通过FLIPR和FlexStation 3系统加入。大约在90秒内对以荧光相对单位标示的信号进行检测，包括加样过程中和加样后。计算后的输出是最大值除以最小值的信号窗口（Δf/f）。图形数据和浓度从ScreenWorks®或SoftMax® Pro软件中直接导出，然后用GraphPad Prism统计。Z-因子计算方法参照Zhang, et. al.文章的描述。

结果

通过检测来自ATCC的CHO M1WT3细胞表达的毒蕈碱受体的激动效应观察FLIPR钙6试剂和其它钙指示剂的比较（图2）。每种染料的最佳孵育时间按照各自的厂家指导说明进行操作。

Fluo-4 wash (Fluo-4W) 染料由于其操作更为复杂以及细胞外荧光背景导致得到的信号窗口最小。FLIPR钙6和钙6-QF表现出更高的信号窗口，Δf/f分别是4和4.2。EC50值保存在每个实验结果中且FLIPR钙6试剂在激动剂检测试验中得到的Z@EC80值为0.88。

变构调节剂的筛选需要检测配体EC30剂量的效应。在这样低剂量浓度的实验中一个大的检测窗口是非常重要的要求。以EC30剂量浓度的卡巴可刺激CHO M1WT3细胞(图 3)。两种FLIPR钙6试剂产生的信号强度均高于其它竞争者试剂的2倍以上。

FLIPR 钙 6 试剂盒可用于大部分的细胞株。图4所示，“实验就绪”的1321N1冻存细胞在FlexStation® 3 微孔读板机上进行检测，其表达了内源性组胺1受体（来自ECACC，Porton Down, Salisbury, UK）。使用FLIPR 钙5 试剂盒、Fluo-4 Direct试剂盒、FLIPR 钙 6 试剂盒和FLIPR 钙 6-QF试剂盒检测到组胺浓度增加引起的组胺受体效应变化的对比结果表明了FLIPR 钙 6 试剂盒可得到最大的信号窗口。SoftMax Pro软件计算得到的EC50值在预期数值对数一半以内。

CHO M1 细胞需要添加阴离子再摄取抑制剂丙磺舒以确保常用的钙离子指示染料，诸如Fluo-3和Fluo-4维持在细胞内。FLIPR 钙 5 试剂盒染料在缺少丙磺舒时也会被排出细胞并检测不到任何效应。FLIPR 钙 6 试剂盒染料荧光团的设计更利于维持在细胞内部。图5展示了FLIPR钙6试剂在没有丙磺舒的条件下记录到一个较小的信号，然而实验结果仍然得到了超过2倍且EC80时Z因子值为0.86的信号窗口。

结论

FLIPR钙6试剂盒和FLIPR钙6-QF试剂盒提供了灵活的钙流检测方法，带来可靠的药理学效应结果、更好的信号窗口以及高质量的实验整体表现。是否具有更高的信号窗口至关重要，因为现今的检测试验表现出来的挑战性在采用过量表达受体进行的标准激动/抑制效应分析研究中未被发现。使用内源性受体或低表达量受体的细胞株、冻存的细胞、原代细胞或干细胞可能产生较低效应的信号反应。FLIPR钙6试剂盒带来的更高信号窗口可以实现强健的化合物筛选和这些具有挑战性的靶标及细胞株优化的实验。另外，更高的信号窗口在进行变构调节剂验证实验中更具优势。FLIPR钙6-QF试剂盒不含有淬灭剂成分为多重性应用或淬灭剂敏感靶标研究提供更多灵活选择。最后，在细胞株中研究靶标表现例如CHO细胞株，不含阴离子再摄取抑制剂的条件对一些可能对丙磺舒敏感的受体更有优势，而且其可能会改变天然的生物作用机制。

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